Сериал фокусируется на группе интернов, их наставников в профессиональной и личной жизни, а также на различных врачах больницы. Продюсеры использовали технику слепого кастинга на главные роли, что привело к этническому разнообразию в актёрском ансамбле. Как позже сказала Шонда Раймс, все персонажи изначально были придуманы без расовых отличий, а обзавелись ими уже когда прошел кастинг, и были отобраны актёры на ту или иную роль. В первом сезоне было пять центральных персонажей-стажеров: Мередит Грей (Эллен Помпео), Алекс Карев (Джастин Чэмберс), Иззи Стивенс (Кэтрин Хейгл), Джордж О’Мэйли (Т. Р. Найт) и Кристина Янг (Сандра О). Сандра О изначально пробовалась на роль Бейли. Их наставником изначально была Миранда Бейли (Чандра Уилсон), которая была сначала ординатором, потом старшим ординатором, а затем стала заведующей отделением общей хирургии больницы «Сиэтл Грейс». Раймс изначально представляла Бейли как эффектную блондинку, однако когда на пробы пришла Уилсон, она изменила своё представление о персонаже. Отделение хирургии находится в ведении главного врача Ричарда Веббера (Джеймс Пикенс-младший), у которого ранее были отношения с матерью Мередит, Эллис Грей (Кейт Бертон). В подчинении Веббера находятся два лечащих врача: Дерек Шепард (Патрик Демпси), и Престон Бёрк (Исайа Вашингтон), специализирующееся в нейрохирургии и кардио-хирургии соответственно. У Шеппарда начинаются отношения с Мередит Грей, а у Бёрка с Кристиной Янг.

Кейт Уолш исполнила роль Эддисон Монтгомери.

В начале второго сезона в шоу вводится несколько новых постоянных персонажей: Акушер и гинеколог а также детский хирург Эддисон Монтгомери (Кейт Уолш), пластический хирург из Нью-Йорка Марк Слоан (Эрик Дэйн) и хирург-ортопед Келли Торрес (Сара Рамирез). Эддисон — жена Шеппарда, которая возвращается в Сиэтл, чтобы помириться с ним. Слоан является бывшим лучшим другом Шеппарда, который помог в распаде их брака с Монтгомери, когда завел с ней роман. Торрес задумывалась как потенциальный любовный интерес для О’Мэйли, за которого она позже вышла замуж, но в конечном счете развелась. Эддисон выписывается из сериала в третьем сезоне, и Кейт Уолш продолжает играть свою роль в спин-оффе под названием «Частная практика», однако периодически возвращается в шоу как приглашённая звезда. В предпоследнем эпизоде третьего сезона появляется новый персонаж, Лекси Грей (Кайлер Ли), сводная сестра Мередит Грей, которая неожиданно решает пройти стажировку в «Сиэтл Грейс», после смерти её матери. В финале третьего сезона сериал покидает Исайя Вашингтон, исполняющий роль доктора Бёрка. Он бросает Янг у алтаря, и уезжает, напоследок прихватив все вещи, которые их связывали, из их общей квартиры.

Кевин МакКидд исполнил роль Оуэна Ханта.

В начале четвёртого сезона в основной актёрский состав зачисляется персонаж, гомосексуальный кардиохирург Эрика Хан (Брук Смит). Хан была повторяющимся персонажем во втором и третьем сезонах шоу. Персонаж был охарактеризован как высокопрофессиональный врач, которого можно отнести к трудоголикам. Хан была выведена из шоу в седьмом эпизоде пятого сезона. В то же время появляется два новых постоянных персонажа: врач по травмам Оуэн Хант (Кевин МакКидд) и детский хирург, лесбиянка, Аризона Роббинс (Джессика Кэпшоу). У Оуэна завязались романтические отношения с Янг, а у Роббинс с Келли Торрес. В пятом сезоне появился новый повторяющийся персонаж Сэди Харрис (Мелисса Джордж), у которой когда то были дружеские отношения с Мередит. Хотя планировалось что Харрис впоследствии станет регулярным постоянным героем, персонаж вскоре был выписан из сюжета, а контракт с актрисой не был продлен.

В первом эпизоде шестого сезона умирает Джордж О’Мэйли, а Иззи Стивенс оправляется после их разрыва с Алексом Каревым. В то же время появляется новый персонаж, кардиохирург Тедди Альтман (Ким Рэйвер), которая ранее служила армейским врачем во время Иракской войны. В шестом сезоне также вводятся несколько заметных повторяющихся персонажей, интерны Рид Адамсон (Нора Зехетнер), Джексон Эйвери (Джесси Уильямс), Эйприл Кэпнер (Сара Дрю) и Чарльз Перси (Роберт Бейкер). Кроме того в сезоне был введен анестезиолог Бен Уоррен (Джейсон Джордж), у которого был краткосрочный роман с Мирандой Бейли. В финале шестого сезона сериал покинули актёры Бейкер и Зехетнер, когда их персонажи были убиты во время перестрелки в больнице, и только Дрю и Уильямс были повышены до основного актерского ансамбля, начиная с седьмого сезона. В финале восьмого сезона сериал покинули Ким Рэйвер и Кайлер Ли. На вопрос, будут ли ещё в будущем новые главные персонажи, создатель и продюсер сериала Шонда Раймс, ответила, что ансамбль и так уже слишком большой, и ввод новых героев пока не планируется